Sent på 1200-tallet finner en gjeter fra Cáceres en madonna-statue nedgravd ved elven Guadalupe, et kapell blir bygget på stedet.

Kong Alfonso XI besøker flere ganger kapellet og etter seieren i slaget ved Salado-elven i 1340 erklærer han kapellet som kongelig og setter i gang et stort byggeprogram.

I 1389 tar Hieronymite ordenen over plassen og gjør det til sitt hovedkloster. De fortsetter utbyggingen under oversyn av den første prioren og i 1474 blir den spanske kongen Henry IV gravlagt her.

Klosteret assosieres sterkt med 'den nye verden' og det var her Columbus dro på pilgrimsferd etter å ha oppdaget amerika og her han takket himmelen for oppdagelsen.

Klosteret fortsetter oppover århundrene å ha en viktig possisjon i den katolske kirke, det har vært vanlig at nyvalgte paver drar på pilgrimsferd hit.

På 1900-tallet tar den fransiskanske ordnenen over driften av klosteret.